Pembuatan preparat squash (pejetan)

PREPARAT SQUASH (PEJETAN)

a.      Tujuan Praktikum:

Untuk mempelajari teknik pembuatan preparat squash dan mempelajari bentuk kromosom suatu sel baik secara mitosis maupun meiosis.

b.      Alat dan Bahan:

1.      Objek glass

2.      Cover glass

3.      Mikroskop elektrik

4.      Kaca arloji

5.      Pipet tetes

6.      Pinset

7.      Kapas

8.      Silet

9.      Botol fial

10.  Alkohol 70%

11.  Alkohol 95%

12.  Larutan FAA

13.  Whittman’s hematoxylin

14.  Asam cuka glasial

15.  Mikroskop stereo

16.  Larutan hidrolisis

17.  Jarum pentul

18.  Hoyer’s mounting (Arabic gum 50 gr + chloral hydrate 20 gr + aquades 50 ml)

19.  Akar bawang yang baru tumbuh

20.  Kuncup bunga cabe

c.       Prosedur Kerja:

Preparat Mitosis

1.      Menanam bawang dengan media air sampai panjang akar mencapai 2-3 cm

2.      Memotong ujung akar bawang dan rendam dalam larutan FAA selama 24 jam

3.      Jika ingin disimpan maka pindahkan dalam alcohol 70%

4.      Merendam potongan akar dalam larutan hidrolisis selama 30 menit. Tujuan dari hidrolisis adalah melunakkan jaringan agar mudah dipejet di kaca objek.

5.      Merendam dalam alkohol 95% minimal selama 30 menit dengan penggantian alkohol minimal 4 kali. Tahap ini sangat penting untuk menghilangkan sisa dan pengaruh HCl dari ujung akar.

6.      Memindahkan potongan akar ke dalam kaca arloji dan rendam dengan whittman’s hematoxylin selama 20 menit

7.      Mencuci potongan akar dengan asam cuka glasial, ganti asam cuka glasial hingga warna asam cukanya jernih. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan dampak negative dari Hematoksilin.

8.      Meneteskan Hoyer’s mounting pada kaca benda dan letakkan potongan akar tepat ditengah tetesan

9.      Menutup dengan cover glass

10.  Melakukan Pejetan terhadap cover pada obyek glass dengan jari sehingga ujung akar hancur dan sel-selnya tersebar

11.  Menunggu Hoyer’s mounting mengering dan amati di bawah mikroskop

Preparat Meiosis

1.      Memetik kuncup bunga cabe yang terkecil dan masukkan dalam larutan FAA selama 24 jam

2.      Memindahkan dalam larutan alcohol 70% bila ingin diawetkan

3.      Membuka kuncup bunga dengan bantuan jarum pentul dan mikroskop stereo

4.      Mengambil bagian kepala sari dan kumpulkan dalam kaca arloji

5.      Merendam dengan larutan hidrolisis selama 30 menit

6.      Merendam dalam alkohol 95% selama 30 menit diulang sampai 4 kali, dengan minimal 4 kali penggantian.

7.      Memindahkan kepala sari ke dalam kaca arloji dan rendam dengan whittman’s hematoxylin selama 20 menit

12.  Mencuci kepala sari dengan asam cuka glasial, ganti asam cuka glasial hingga warna asam cukanya jernih. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan dampak negative dari Hematoksilin.

8.      Meneteskan Hoyer’s mounting pada kaca benda dan letakkan kepala sari tepat ditengah tetesan lalu tutup dengan coverglass

9.      Melakukan pejetan terhadap cover pada obyek glass dengan jari sehingga kepala sari hancur dan sel-selnya tersebar

10.  Menunggu sampai perekat (Hoyer’s mounting) mengering dan amati di bawah mikroskop

d.      Hasil Praktikum:

Mitosis

Meiosis

					Perbesaran 600X
	Metafase
				Perbesaran 600X

 

				Telofase
		Perbesaran 600X

 

e.Analisis:

Preparat Mitosis

Praktikum ini menggunakan akar bawang merah karena bawang merupakan tanaman yang mudah didapat dan sel-selnya cukup besar dan tahapan pembelahan selnya bisa terlihat jelas. sehingga mudah diamati tahapan mitosisnya dengan bantuan mikroskop. Bagian yang digunakan adalah ujung akar karena pada ujung akar merupakan bagian meristematik yang masih aktif membelah sehingga mudah memperoleh tahapan-tahapan mitosisnya.

Akar bawang dipotong menggunakan silet yang baru karena pada proses pemotongan akar bawang sangat lunak sehingga memerlukan alat pemotong yang tajam agar tidak merusak komponen sel. Pinset digunakan untuk mengambil bagian akar yang sudah dipotong dan memasukkannya pada botol fial agar tidak tergencet. Botol fial berisi larutan fiksatif yaitu FAA, fungsi dari FAA adalah untuk menghentikan aktivitas mitosis dan mempertahankan kondisi sel akar bawang sebagaimana saat memotongnya. Sehingga bisa disimpan dalam waktu yang cukup lama. Pemotongan dilakukan pada malam hari karena proses mitosis aktif pada malam hari, sehingga mudah mendapat fase-fase pada mitosis.

Akar dikeluarkan dari botol yang berisi FAA dan direndam di dalam alkohol 70%, perendaman bertujuan untuk menghilangkan sisa-sisa FAA yang masih terdapat di dalam sel ujung akar bawang merah. Perendaman dengan alkohol bertujuan untuk menyegarkan kembali sel ujung akar bawang setelah dimasukkan kedalam FAA. Kemudian merendam akar dalam larutan hidrolisis untuk melunakkan dinding sel sehingga mudahkan dalam memotong tudung akar bawang merah karena dengan pemberian hidrolisis tudung akar menjadi berwarna lebih putih dibandingkan sel lainnya sehingga dapat memperjelas batas tudung akar dengan sel-sel diatasnya. Untuk menghilangkan sisa HCl maka ujung akar di cuci dengan alcohol 95%.

Setelah pencucian dari HCL, dilakukan pemberian larutan hematoksilin weitmen. hematoksilin weitmen adalah pewarna, sehingga jelas berfungsi  untuk memberi pigmen kepada sel ujung akar bawang sehingga mudah untuk diamati dan terlihat pada saat diamati dibawah mikroskop. Perlakuan yang terakhir adalah meletakkan bagian akar pada gelas objek dan kemudian ditutup dengan cover glass yang telah diberi perekat hoyer dan ditekan menggunakan ujung pencil agar sel menyebar dan tidak merusak sel yang akan diamati.

Pada preparat mitosis ini terlihat hasil yang cukup bagus, karena hampir semua fase dalam mitosis ada. Yaitu prophase dimana kromatin membentuk benang kromosom, metaphase yang merupakan phase dimana kromosom berada di bidang ekuator, anaphase dimana merupakan phase yang menunjukkan kromosom sudah mengarah ke kutub yang berlawanan akibat penarikan benang spidel, telophase dimana sudah terbentuk dua inti akan tetapi belum terjadi pemisahan membrane dengan sempurna, dan yang paling banyak adalah Interphase, yaitu phase istirahat dan tidak terjadi proses pembelahan sel.

Preparat Meiosis

Praktikum ini menggunakan kuncup bunga cabai yang paling kecil. Bagian yang digunakan adalah serbuk sari karena meiosis hanya terjadi pada fase reproduksi. Sebelumnya, akar bawang dipotong menggunakan silet baru karena pada proses pemotongan, akar bawang sangat lunak sehingga memerlukan alat pemotong yang tajam agar tidak merusak komponen sel. Pinset digunakan untuk mengambil bagian akar yang sudah dipotong dan memasukkannya pada botol fial agar tidak tergencet. Botol fial berisi larutan fiksatif yaitu FAA, fungsi dari FAA ini adalah untuk menghentikan aktivitas mitosis dan mempertahankan kondisi sel akar bawang sebagaimana saat memotongnya.

Selanjutnya kuncup bunga cabai direndam di dalam alkohol 70%, perendaman ini bertujuan untuk menghilangkan sisa-sisa FAA yang masih terdapat di dalam kuncup bunga cabai. Selain itu perendaman dengan alkohol bertujuan untuk menyegarkan kembali kuncup bunga cabai setelah dimasukkan kedalam FAA.

Kemudian kuncup bunga cabai dikeluarkan dari botol dan dibelah menggunakan jarum pentul dengan bantuan mikroskop stereo untuk diambil bagian kepala sarinya. Kepala sari tersebut kemudian direndam dengan larutan hidrolisis hal ini bertujuan melunakkan dinding sel sehingga memudahkan dalam pemejetan. Untuk menghilangkan sisa HCl maka ujung akar di cuci dengan alcohol 95%.

Setelah proses pencucian dengan HCL, dilakukan pemberian hematoksilin weitmen. Fungsi hematoksilin weitmen adalah untuk memberi warna kepada sel kepala sari sehingga mudah untuk diamati dan terlihat pada saat diamati dibawah mikroskop. Perlakuan yang terakhir adalah meletakkan bagian kepala sari pada gelas objek dan kemudian ditutup dengan cover glass yang telah diberi hoyer kemudian ditekan menggunakan ujung pencil agar selnya menyebar dan tidak merusak sel yang akan diamati.

Pada meiosis tidak sebagus mitosis walaupun fase-fasenya cukup lengkap, tetapi fase-fasenya tidak sejelas pada mitosis, selnya pun relatif lebih kecil dibandingkan mitosis sehingga tidak begitu jelas.

e.       Pembahasan

Preparat Mitosis

Preparat mitosis terlihat hasil yang cukup bagus, karena hampir semua fase dalam mitosis ada. Fase tersebut antara lain prophase dimana kromatin membentuk benang kromosom, metaphase yang merupakan fase dimana kromosom berada di bidang ekuator, anaphase yaitu fase  yang menunjukkan kromosom sudah mengarah ke kutub yang berlawanan akibat penarikan benang spidel, telophase dimana sudah terbentuk dua inti akan tetapi belum terjadi pemisahan membrane dengan sempurna, dan yang paling banyak adalah Interphase, yaitu phase istirahat dan tidak terjadi proses pembelahan sel.

Tahapan- tahapan mitosis, antara lain:

1. Profase

Tahap ini menunjukkan benang - benang kromatin berubah menjadi kromosom. Setiap kromosom membelah menjadi kromatid dengan satu sentromer. Dinding inti dan anak inti menghilang dan pasangan sentriol yang terdapat dalam sentrosom berpisah dan bergerak menuju kutub yang berlawanan dan juga serat-serat gelendong atau benang-benang spindle terbentuk diantara kedua kutub pembelahan.  Awal profase, sentrosom dengan sentriolnya mengalami replikasi dan dihasilkan dua sentrosom. Masing-masing sentrosom hasil pembelahan bermigrasi ke sisii berlawanan dari inti. Pada saat bersamaan, mikrotubul muncul diantara dua sentrosom dan membentuk benang-benang spindle, yang membentuk seperti bola sepak. Pada saat bersamaan, kromosom teramati dengan jelas, yaitu terdiri dua kromatid identik yang terbentuk pada interfase. Dua kromatid identek tersebut bergabung pada sentromernya. Benang-benang spindel terlihat memanjang dari sentromer

2. Metafase

Tahapan ini setiap kromosom yang terdiri dari sepasang kromatida menuju ketengah sel dan berkumpul pada bidang pembelahan (bidang ekuator), dan menggantung pada serat gelendong melalui sentromer atau kinetokor. Masing-masing sentromer mempunyai dua kinetokor dan masing-masing kinetokor dihubungkan ke satu sentrosom oleh serabut kinetokor. Sementara itu, kromatid bersaudara begerak ke bagian tengah inti membentuk keping metafase (metaphasic plate).

3. Anafase

Pembelahan sudah nampak dengan adanya kromosom-kromosom homolog saling berjauhan. Kromosom nampak jelas mengalami penebalan sehingga dapat dilihat jelas dengan mikroskop cahaya sekalipun. Kromatid memisahkan diri dari sentromer dan masing-masing kromosom membentuk sentromer. Masing-masing kromosom ditarik oleh benang kinetokor ke kutubnya yang berlainan satu sama lain.

4. Telofase.

Pada fase ini terjadi beberapa peristiwa kromatida yang berada di kutub berubah menjadi benang kromatin kembal, terbentuk kembali dinding inti dan nucleolus membentuk dua inti baru, serat - serat gelendong menghilang. terjadi pembelahan sitoplasma (sitokenesis) menjadi dua bagian, dan terbentuk membrane sel pemisah ditengah bidang pembelahan. Akhirnya , terbentuk dua sel anak yang mempunyai jumlah kromosom yang sama dengan kromosom induknya.

Pada preparat mitosis akar bawang merah hanya didapatkan tahap profase, metaphase, dan anafase saja. Sedangkan untuk fase telofase sangat sulit didapatkan karena kurang baiknya hasil preparat ini yang mungkin disebabkan oleh teknik pejetan yang kurang maksimal (merata) dan kualitas pewarna yang kurang baik.

Preparat Meiosis

Praktikum meiosis ini menggunakan kuncup bunga cabai. Pada praktikum kali ini terdapat beberapa kendala yang menyebabkan sulitnya menemukan fase tetrad yaitu saat pemetikan kuncup bunga cabai yaitu pada pukul 23.00-00.00, karena pada waktu ini terjadi peristiwa meiosis secara maksimal namun hal ini tidak dilakukan dan pemetikan dilakukan pada sore hari. Pemetikan kuncup bunga cabe juga harus memilih kuncup yang bebar-benar kecil dan yang belum dapat dibedakan antara kelopak dan mahkota bunga. Selain itu pewarna hematoxylin whittman yang digunakan mengalami penurunan kualitas karena penyimpanannya sudah terlalu lama. Hal ini mengakibatkan perubahan warna, yang seharusnya pewarna tersebut akan nampak biru keunguan saat menyatu dengan  sel yang diwarna berubah menjadi coklat kehitaman.

Teknik pejetan juga berpengaruh besar pada hasil preparat ini. Pejetan yang tidak maksimal akan menyebabkan banyak sel yang saling tumpang tindih (tidak menyebar merata) sehingga sulit untuk diidentifikasi fase-fasenya (terutama saat fase tetrad). Tidak maksimalnya hasil pejetan juga dimungkinan oleh perendaman pada asam cuka glasial. Kurangnya perendaman menyebabkan spesimen keras sehingga tidak mudah dilakukan teknik pejetan yang menyebabkan sel-sel tidak dapat menyebar merata. Sedikitnyafase yang terlihat dikarenakan waktu pengambilan kuncup bunga cabai tidak pada saat membelah, selain itu ukuran sel yang cukup kecil sehingga sangat sulit untuk mengamati fase-fasenya.  Mikroskop yang perbesaranya terbatas juga mempengaruhi pengamatan. Pada saat pemejetan juga kurang tipis akibatnya sel kurang menyebar dan menumpuk.