Pembuatan preparat irisan

PREPARAT IRISAN

a.      Tujuan Praktikum:

1.             Mengetahui bagaimana cara membuat preparat dengan menggunakan metode paraffin.

2.             Mengetahui bentuk-bentuk mikroanatomi irisan melintang akar, batang, dan daun tanaman.

3.             Mengetahui bentuk-bentuk mikroanatomi dan histology irisan melintang usus ayam.

b.      Alat dan Bahan:

Parafin Tumbuhan

1.   Mikrotum

2.   Thermostat

3.   Kaca benda

4.   Cover glass

5.   Hitter

6.   Pipet

7.   Spesimen daun kangkung

8.   Batang kangkung

9.   Akar bayam

10.           Kapas

11.           Balok kayu 1,5³ cm

12.           Larutan fiksatif  (Formalin-aceto-alkohol)

13.           Alkohol 70% :  As. Asetat Glasial :  Formalin:  90        :           5              :       5

14.           Alkohol 60%

15.           Alkohol 70%

16.           Alkohol 80%

17.           Alkohol 95%

18.           Alkohol absolut

19.           Aquades

20.           Alkohol-xilol perbandingan  1: 3  ;  1: 1   ;  3: 1

21.           Xilol murni

22.           Xilol- parafin  1: 9

23.           Parafin murni

24.           Safranin Alkoholik 1%

25.           Fastgreen

26.           Perekat Mayer (albumin dan gliserin ditambah sedikit kristal phenol)

27.           Entellan

Parafin Hewan

1.      Organ usus ayam

2.      Kaca benda

3.      kaca penutup

4.      pipet

5.      Alkohol absolute

6.      Alkohol 95%

7.      alkohol 90%

8.      alkohol 80%

9.      Alkohol 70%

10.  alkohol 60%

11.  Alkohol 50%

12.  alkohol 40%

13.  Alkohol 30%

14.  Hematoksilin

15.  E o s i n

16.  Campuran alcohol : xilol = 3:1

17.  Campuran alcohol : xilol = 1:1

18.  Campuran alcohol : xilol = 1:3

19.  Meyer

20.  Albumin

21.  Mikrotom

22.  Oven

23.  gelas kimia

24.  hitter

25.  paraffin

26.  entelan

27.  Balok kayu 1,5³ cm

28.  Tisu

c.       Prosedur Kerja:

Parafin Tumbuhan

1.      Merendam spesimen dalam larutan fiksatif selama 24 jam

2.      Melakukan dehidratasi dengan :

Alcohol 70%

Alcohol 80%

Alcohol 95%               direndam selama 30 menit

Alcohol 96%

Alcohol 96%

3.      Melakukan dealkoholisasi dengan :

Alcohol : xilol 3: 1

Alcohol : xilol 1: 1

Alcohol : xilol 1: 3                 direndam masing-masing selama 30 menit

               Xilol pertama

                     Xilol kedua

                     Xilol- parafin 1: 9                          disimpan selama 24 jam suhu 57⁰C

4.      Campuran xilol-parafin dibuang lalu diganti dengan parafin murni dalam suhu 57⁰C selama 24 jam

5.      Membuat balok parafin dengan specimen di dalam paraffin

6.      Membuat irisan specimen dengan mikrotum ketebalan 8 mikronmeter

7.      Irisan direkatkan pada kaca benda yang telah diolesi perekat Mayer

8.      Meletakkan dalam thermostat suhu 45⁰C sampai pita parafin meregang

9.      Tahap pewarnaan

10.  Berturut- turut kaca benda berisi specimen ditetesi dengan :

                        Xilol pertama

                        Xilol kedua

            Alkohol : xilol 1: 3          

              Alkohol : xilol 1: 1

            Alkohol  : Xilol 3:1

 

            Alkohol absolut 1                    direndam selama 3 menit

            Alkohol absolut 2

                         Alcohol 95%                  direndam selama 3 menit

                        Alcohol 80%

                       Alcohol 70%

Safranin Alkoholik 1%                       selama 5 menit

                         Alkohol 70%

                     Alkohol 80%                       selama 3 menit      

                        Alkohol 95%

     

                        Fastgreen                     selama 10-20 detik

 

            Alkohol absolute 1

            Alcohol absolute 2

            Alkohol : xilol 3: 1

            Alkohol : xilol 1: 1                    direndam masing-masing selama 3 menit

             Alkohol : xilol 1: 3         

             Xilol pertama

            Xilol kedua

11.  Irisan ditutup dengan kaca penutup yang telah ditetesi dengan entellan

12.  Preparat dikeringkan dalam thermostat 45⁰C

Parafin Hewan

1.      Persiapan di laboratorium, menyediakan semua alat dan bahan yang diperlukan. Dan membuat larutan-larutan yang diperlukan

2.      Fiksasi specimen dengan fiksatif BOUIN

3.      Melakukan pencucian dan dehidrasi

4.      Fiksatif dibuang dan berturut-turut diganti dengan
Alkohol 50%
Alkohol 50%
Alkohol 70%
Alkohol 95%
Alkohol 100%

5.      Melakukan dealkoholisasi.
Alkohol dibuang, berturut-turut diganti dengan
Campuran Alkohol : xilol = 3:1
Campuran Alkohol : xilol = 1:1
Campuran Alkohol : xilol = 1:3
Xilol Pertama
Xilol kedua.
Campuran xilol : paraffin = 1:9              disimpan selama 24 jam dengan suhu 57^oC

6.      Melakukan infiltrasi
Campuran xilol-parafin dibuang, diganti dengan paraffin murni dalam suhu 57^oC

7.      Parafin dibuang, diganti yang baru

8.      Membuat blok/balok paraffin

9.      Membuat irisan dengan mikrotum dengan ketebalan 8 mikronmeter.

10.  Mengiris balok paraffin dan direkatkan pada kaca benda yang telah diolesi perekat Mayer (Gliserin-Albumin).

11.  Meletakkan irisan dalam thermostat dengan suhu 45^oC sampai pita paraffin meregang.

12.  Deparafinisasi
Xilol : Alkohol = 3 : 1
Xilol : Alkohol = 1 : 1
Xilol : Alkohol = 1 : 3
Akohol absolute

13.  Pewarnaan
Pewarnaan ganda dengan Hematoksilin dan Eosin. Berturut-turut kaca benda ditetesi dengan:

14.  Alkohol absolute
Alkohol 95%
alkohol 90%
alkohol 80%
Alkohol 70%
alkohol 60%
Alkohol 50%
alkohol 40%
Alkohol 30%
Hematoksilin
Alkohol 30%
Alkohol 50%
Alkohol 70%
Alkohol 95%
E o s i n
Alkohol absolute
Alkohol absolute
Campuran alcohol : xilol = 3:1
Campuran alcohol : xilol = 1:1
Campuran alcohol : xilol = 1:3
Xilol pertama
Xilol kedua

15.  Irisan ditutup dengan kaca penutup yang telah ditetesi dengan entellan.

16.  Preparat dikeringkan dalam thermostat dengan suhu 45^oC

d.      Hasil Praktikum:

Parafin Daun Kangkung

Perbesaran 600X

Floem

Perbesaran 400X

 

			Perbesaran 400X
	Perbesaran 600X

 

Perbesaran 600X

Parafin Batang Kangkung

			Perbesaran 600X Ketebalan 8 mikronmeter
	Perbesaran 600X

 

							Floem
						Xilem
	Perbesaran 600X

 

Parafin Akar

				Perbesaran 600X
	Perbesaran 400X Ketebalan  8 mikronmeter

 

Perbesaran 600X

Perbesaran 600X

Perbesaran 600X

Parafin Hewan

		Perbesaran 600X
	Perbesaran 400X Ketebalan 10 mikronmeter

 

										Lapisan muskularis mukosa
	Perbesaran 600X

 

e.       Analisis

Dalam membuat preparat paraffin pertama-tama yang dilakukan adalah fiksasi. Yaitu dengan cara memotong spesimen menjadi bagian kecil-kecil (1cm) lalu fiksasi dalam selama 24 jam, FAA sebagai larutan fiksatif yang digunakan untuk menjaga sel dalam waktu tertentu atau tidak terbatas dan tanpa mengalami kerusakan. Tahap selanjutnya yaitu pencucian dan dehidratasi, yaitu larutan fiksatif dibuang dan diganti dengan menggunakan alkohol berseri (Alkohol 70%, alkohol 80%, Alkohol 95%, Alkohol 96% masing-masing selama 30 menit. Dehidrasi berfungsi untuk membuat preparasi permanen, sehingga ketika dipotong tidak rusak dan dapat disimpan dalam waktu yang lama. Alkohol digunakan karena alkohol bersifat menarik air sehingga jaringan mengkerut dan mengeras.

Selanjutnya dilakukian dealkoholisasi, yaitu alkohol dibuang dan secara berturut-turut diganti campuran alkohol : xilol = 3:1, campuran alkohol : xilol = 1:1, campuran alkohol : xilol = 1:3, xilol pertama, xilol kedua masing-masing selama 30 menit. Kemudian pada campuran xilol : parafin = 1:9 dengan suhu 570 C selama 24 jam. Setelah itu diganti dengan parafin murni yang dilakukan oven 57 oC selama 24 jam. Infiltrasi merupakan tahapan untuk mengganti jaringan yang telah terdehidrasi ke media embedding, selama proses infiltrasi berlangsung ruang intraseluler diisi oleh parafin, sehingga akan membantu untuk mendapatkan potongan yang halus tanpa kerusakan pada mikrotom.

Tahap selanjutnya  dilakukan penyelubungan dengan membuang paraffin lama dan menggantinya dengan yang baru dan dibentuk menjadi blok. Kemudian mengiris mengggunakan mikrotom dengan ketebalan irisan 8 µm, trimming dilakukan untuk merapikan tepi-tepi parafin menjadi bentuk piramid dengan tujuan agar lebih kuat untuk dilakukan pemotongan, irisan diambil dengan pinset kemudian diletakkan pada obyek glass kemudian dilakukan pewarnaan ganda dengan safranin 1% dalam alkohol 70% dan fastgreen dalam alkohol absolut seperti prosedur di atas. Setelah selesai dilakukan pewarnaan kemudian slide ditetesi dengan entelan dan ditutup dengan coverslip, entelan digunakan untuk melakukan mounting dan untuk merekatkan.

f. Pembahasan

Berdasarkan hasil pembuatan preparat Daun Kangkung struktur yang teramati tampak jelas pada bagian tuloang daun sehingga terlihat berkas pembuluh xylem dan floemnya. Sedangkan pada bagian lamina kurang begitu jelas, sel-selnya terlihat tertumpuk sehingga terlihat padat dan gelap karena pewarnaan fastgreen.  Hal ini terjadi karena pada saat pengirisan dimungkinkan lamina daun kangkung terlalu tipis sehingga saat pengirisan bersamaan dengan tulang daun, bagian lamina ini teriris lebih tebal disbanding dengan tulang daunnya.  Pada awal pemberian entelan pada preparat muncul gelembung yang kecil-kecil dan cukup banyak. Hal ini dikarenakan pada saat pompa vakum terjadi kesalahan sehingga ruang pada specimen terisi oleh udara. Fiksasi yang kurang baik karena tidak menggunakan eksikator yang sudah dipasang selang vacuum sehingga larutan fiksatif sulit untuk dapat masuk ke dalam jaringan. Hal ini akan berpengaruh besar pada tahapan-tahapan selanjutnya.

Pada hasil preparat paraffin Batang Kangkung kurang bagus,  sel yang teramati terlihat tebal, struktur lingkaran batang kangkung tidak bulat seperti saat masih segar, dan terdapat rongga udara, namun dapat terlihat berkas pembuluhnya yaitu xylem dan floem.. Sedang pada batang bayam sel-sel juga terlihat tertumpuk dan tebal. Hal  ini terjadi karena struktur batang kangkung sendiri yang lunak sehingga ketika diselubungi dengan paraffin, batang ini menjadi tertekan dan berubah bentuk. Sel yang teramati terlihat tebal mungkin saat pengirisan kurang tipis sehingga sel bertumpuk-tumpuk. Timbulnya gelembung karena pada saat merekatkan dengan enthellan kurang pejetan sehingga masih ada gelembungnya.

Pada hasil preparat paraffin Akar Bayam sel-sel terlihat jelas, sel-sel terlihat tebal, namun berkas pembuluh dapat terlihat jelas. Hal tersebut dapat terjadi karena hal-hal sebagai berikut:

Penyelubungan tidak menggunakan perbandingan parafin lunak : parafin keras  yaitu 3:1 dengan titik cair pada parafin lunak 48⁰ C dan pada parafin keras 580 C. Karena keterbatasan menyebabkan penyelubungan hanya menggunakan parafin keras dengan titik cair yang tidak jelas. Hal ini menyebabkan spesimen sulit untuk dilakukan pengirisan pada mikrotom. Spesimen menjadi sangat keras, sehingga saat diiris dengan mikrotom  menjadi hancur dan spesimen keluar dari blok paraffin. Pada waktu mengiris spesimen sering terjadi kerusakan terutama pada specimen akar, sehingga kebanyakan yang jadi adalah specimen batang. Sedikitnya waktu mengakibatkan hanya satu jenis prepatat irisan yang dapat dibuat, yaitu batang. Pawa waktu mengiris blok juga tidak begitu melekat dengan gagang kayu, sehingga mudah patah.

Pada preparat hewan, hasilnya terlihat tipis, terlihat bagian-bagian yang jelas seperti sel mukosa, muskularis, dan serosa.